ГОСТ 26075-2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ЖИВОТНЫЕ

Методы лабораторной диагностики бешенства

Animals. Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введения 2015-01-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. N 57-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97		Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения		Минэкономики Республики Армения
Беларусь		Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия		Кыргызстандарт
Молдова		Молдова-Стандарт
Россия		Росстандарт
Узбекистан		Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. N 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 года

5 ВЗАМЕН ГОСТ 26075-84


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:

- метод флуоресцирующих антител (МФА);

- метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1);

- биопроба на белых мышах;

- метод иммуноферментного анализа (ИФА);

- реакция диффузионной преципитации (РДП).

Примечания

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavirus .

2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).

3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест-систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 2768-84 Ацетон технический. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84) Шприцы инъекционные однократного применения

ГОСТ 25046-81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабдовирус), и приводящее к летальному исходу в 100% случаев.

3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.

3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.

3.1.2* метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.
________________

3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства, основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

3.1.3* биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.
________________
* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства, основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс "антиген-антитело", наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ФАГ - флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;

АнГ - антирабический глобулин;

КФГ - контрольный флуоресцирующий глобулин;

ФБР - фосфатно-буферный раствор;

НГУК-1 - невринома Гассерова узла крысы;

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцинат;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

CCL-131 - культура клеток мышиной нейробластомы;

ОФД - ортофенилдиамин;

ТМБ - тетраметилбензидин.

4 Условия выполнения исследований и требования безопасности

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I-II групп патогенности - по ГОСТ ISO 7218 .

4.1.2 Общие требования к помещениям - по ГОСТ ISO 7218 .

4.1.3 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218 , ГОСТ ИСО/МЭК 17025 , .

К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I-II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ, вакцинированные против бешенства.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008 .

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011 .

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005 .

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004 .

4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0,11±0,20) МПа.

5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные

5.1 Для проведения исследований используют:

- спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ±0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0,1 до 3,0;

- планшеты для иммунологических реакций 96-луночные;

- термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 °С до 50 °С;

- холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0 °С до 10 °С по ГОСТ 16317 ;

- центрифугу лабораторную;

- баню водяную;

- микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074 ;

- ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025 ;

- стекла предметные по ГОСТ 9284 ;

- пробирки стеклянные по ГОСТ 25336 ;

- чашки Петри по ГОСТ 25336 ;

- кювету по ГОСТ 25336 ;

- пипетки вместимостью 1,0; 2,0 и 10,0 см по ГОСТ 29230 ;

- пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см с наконечниками;

- пинцеты медицинские по ГОСТ 21241 ;

- шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861 ;

- иглы инъекционные по ГОСТ 25046 ;

- стекла культуральные на восемь лунок;

- клетки для содержания мышей;

- ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768 ;

- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);

- антирабический глобулин (АнГ);

- контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);

- масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739 ;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709 ;

- раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0,01 моль/дм (ФБР), рН 7,2-7,4;

- раствор натрия хлорида стерильный 0,9%-ный изотонический;

- культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1;

- пенициллин;

- стрептомицин;

- среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), рН 7,2;

- раствор трипсина 0,25%-ный;

- сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10%-ную;

- глютамин 3%-ный:

- перекись водорода 3%-ную по ГОСТ 177 ;

- набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;

- раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм по ГОСТ 4204 ;

- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026 ;

- штамп для приготовления лунок;

- мертиолят;

- агар "Дифко" или аналогичный;

- раствор метилового оранжевого 1%-ный в 50%-ном этиловом спирте;

- антигены положительный и отрицательный;

- сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;

- мышей белых клинически здоровых массой 6-8 г.

5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.

6 Отбор проб

6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал - свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.

6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.

6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные: наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-эпизоотологические данные.

6.4 Лабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.

6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0,5-1,0 см, мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.

Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неспецифической флуоресценции.

Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30%-50%-ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 °С.

7 Метод флуоресцирующих антител (МФА)

7.1 Сущность метода

Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс "антиген-антитело", меченный ФИТЦ, обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка проб

7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патологического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.

7.2.1.2 Приготовление отпечатков

Кусочки ткани, отобранные по 6.5, кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре-шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пинцетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре-шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.

7.2.1.3 Приготовление мазков

Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5, растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.

7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, как описано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.

7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин, фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4 °С в течение 4-12 ч или при температуре минус 20 °С в течение 1 ч, после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10-15 мин.

7.2.2 Подготовка реактивов

ФАГ, АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ, АнГ и КФГ при температуре (5±2) °С - не более двух недель.

Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ, АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ, АнГ и КФГ используют в день приготовления.

7.3 Проведение исследования

Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами, помещают в термостат при температуре (37±1) °С и выдерживают в течение 30 мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ, помещают в термостат при температуре (37±1) °С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20-30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ, как описано выше.

7.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым, серовато-желтым цветом.

Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15-20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.

Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ, подобных образований быть не должно.

О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

В случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.

8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1)

8.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL31 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.

Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Подготовка проб

Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5, измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0,9%-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10%-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см и 1 мг/см соответственно.

Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об./мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.

8.2.2 Подготовка культуральных стекол

Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25%-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10%-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3%-ным глютамином до концентрации 210 клеток/см. В лунки культурального стекла вносят по 0,1 см полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный -инкубатор с содержанием 5% при температуре (37±1) °С на 18-20 ч.

8.3 Проведение исследования

В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0,05 см суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства - штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный -инкубатор с содержанием 5% при температуре (37±1) °С на 42-48 ч.

По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0,2 см раствора в каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20-30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0,1 см охлажденного до температуры минус 20 °С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20-30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0,05-0,10 см ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 30 мин.

По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.

8.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым, серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).

Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.

Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.

Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.

9 Биопроба на белых мышах

9.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.

9.2 Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

9.3 Проведение исследования

Пять-шесть белых мышей заражают 10%-ной суспензией патологического материала интрацеребрально в объеме 0,02-0,03 см. Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на которую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.

9.4 Обработка результатов

При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взъерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.

Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включения вируса бешенства.

Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.

Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.

10 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

10.1 Сущность метода

В основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антителом, иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой, продукт реакции которой окрашивается при добавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.

10.2 Подготовка к исследованию

10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.

10.2.2 Приготовление исследуемого антигена

Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10%-ные суспензии в 0,9%-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 °С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об./мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.

10.2.3 Подготовка реагентов

Все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22±1) °С.

Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.

10.3 Проведение исследования

10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.

Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.

Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет 0,1 см.

10.3.2 Сенсибилизация планшета

В лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 3 ч или при температуре 4 °С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают, а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.

10.3.3 Внесение антигенов

В ряды планшета A, B и C вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка A1) и отрицательный (лунка A2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки A3, A4 и т.д.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1:2 до 1:8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.

10.3.4 Внесение антирабического пероксидазного конъюгата

В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.

10.3.5 Внесение субстратной смеси

Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15-30 мин при температуре (22±0,5) °С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм.

10.4 Обработка результатов

Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.

Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД, то измерение оптической плотности проводят при 490 нм, если используют ТМБ, то при 450 нм.

Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.

При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности , который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности более 2,1 и отрицательной, если менее 2,1.

Пример

ОП 0,641, ОП 0,120, 5,34 - реакция положительная или ОП 0,180, ОП 0,120 1,5 - реакция отрицательная.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7-9.

11 Реакция диффузионной преципитации (РДП)

11.1 Сущность метода

Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс "антиген-антитело", наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

11.2 Подготовка к исследованию

11.2.1 Подготовка проб

Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.

11.2.2 Подготовка агара

Для приготовления агара смешивают 1,5 г агара "Дифко", 1 см 1%-ного раствора метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте, 0,01 г мертиолята, 100 см изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 °С.

11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)

Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2,5 см расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм, и оставляют на 20-30 мин. В застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4-5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.

Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10-15 см расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.

11.3 Проведение исследования

Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1,0 см изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1,0 см антирабической сыворотки, получая разведение 1:2, перемешивают, и переносят 1,0 см смеси во вторую пробирку и т.д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16.

В приготовленные лунки вносят по 0,05-0,07 см пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1, и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) согласно рисунку 1.

Рисунок 1 - Схема внесения материала

Ар - аммонов рог; Пм - продолговатый мозг; А+ - положительный контрольный антиген; М - мозжечок; К - кора больших полушарий; А- - отрицательный контрольный антиген

Возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.

Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37±1) °С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).

Реакцию учитывают через 6, 24 и 48 ч.

11.4 Обработка результатов

Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).

При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7-10.

Библиография

ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use



УДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220

Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации

____________________________________________________________________________________

Электронный текст документа
подготовлен ЗАО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2014

Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.

Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результа­тов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении те­лец Бабеша - Негри и биопробе на белых мышах.

В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мел­ких животных, от крупных животных - голову или головной мозг. В некоторых случаях до­пускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг - в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницае­мую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологи­ческим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.

Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).

Индикация и идентификация вируса . Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша - Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.

Обнаружение специфических телец-включений . Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматрива­ют в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша - Негри (при окраске по Селлерсу - четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплаз­ме, при окраске по Муромцеву - светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша - Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.

Наиболее характерная особенность телец Бабеша - Негри - их внутренняя структура, по­зволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки - базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.

Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша - Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами иден­тификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравле­ния змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша - Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследу­ется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).

ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном вы­полнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микро­скопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в ви­де ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаружи­вают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.

Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод по­давления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфиче­скими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого голов­ного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресци­рующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким обра­зом препаратах флюоресценции не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предвари­тельно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования по­дозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, по­кусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все прави­ла личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим ве­ком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для кон­троля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в тече­ние 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.

В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубаци­онного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера - от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного - не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более кле­ток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здо­ровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.

Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постанов­ке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период забо­левания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря матери­ал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса нерав­номерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.

Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или лате­ральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них де­лают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с дан­ными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корре­ляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге жи­вотных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микро­методом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой ме­тодике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А - аммонов рог (правая сторона); В - кора головного мозга (правая сторона); С - мозжечок (правая сторона);
Д - продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) - положительный контроль; - (минус) - отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 - лунки с разведе­нием специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастооб­разную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом (на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм ге­лем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.

РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в ис­следуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полу­ченного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в иссле­дуемом материале телец Бабеша - Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.

Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша - Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказыва­лась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.

Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции ис­пользуют недостаточно разведенный материал.

В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скун­сов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.

Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хо­мячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.

РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового от­дела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнат­ной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.

ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА - наиболее перспективный лабораторный метод обнару­жения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является тех­ника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно пре­восходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термола­бильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и "утиных" штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.

Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, исполь­зуя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реаги­руют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии компле­мента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ исполь­зовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика . Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT ис­пользуют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксиро­ванный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выяв­лении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.

РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за на­личия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствите­лен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувстви­тельностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращен­ный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугирова­нием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активно­стью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гу­синых эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавле­нием 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, оконча­тельный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус - через 1-1,5 ч.

Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связы­ваться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммун­ной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие ре­зультаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.

Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сы­воротке и гибридомных супернатантах.

Дифференциальная диагностика . Необходимо исключить болезнь Ауески, при кото­рой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломие­лите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.

Бешенство представляет собой вирус, передающийся человеку через инфицированное животное вследствие укуса или путем попадания зараженной слюны. Данное заболевание не поддается лечению, ведь до сих пор медицина не нашла противодействие подобному заражению. Бешенство начинает проявляться только через несколько дней, летальный исход наступает через пару дней после начала заражения. Дабы не столкнуться с этой проблемой, можно предотвратить ее появление путем вакцинации. Так же прививка может оказать противодействие в первые же часы после укуса.

При укусе животным необходимо незамедлительно сдать анализ на бешенство. Данный вирус передается человеку от зараженного животного. Наиболее распространенные случаи заражения от диких не привитых животных (лисица, волк, мышь, енот) или домашних, которые не были привиты в течение года(собака, кошка, рогатый скот).

Заразиться от больного животного можно в процессе следующих обстоятельств:

• во время укуса зараженного животного;
• при попадании слюнных выделений на слизистую человека или поврежденные участки кожи. Это может быть рана или обычная царапина.

При любом виде контакта со слюной зараженного животного, необходимо незамедлительно обратиться в медицинское учреждение для проведения профилактических мер, так как лечению данный вид заражения не поддается. Не исключено заражение в процессы вдыхания воздуха или частиц пыли, которые содержат инфекцию, в медицинской практике есть случаи инфицирования в процессе обработки лисьих шкур. Контакт с фекалиями или мочой больного животного не грозит заболеванием, то же самое касается и неповрежденной кожи. Мясо без обработки не содержит в себе вируса, профилактика после употребления необработанного мяса не нужна.

Важно знать, что вирус бешенства не передается от людей к человеку, поэтому не нужно опасаться такого человека, нужно своевременно ему помочь.

Симптоматика

Инфицирование не сопровождается симптомами мгновенно, для их выявления может понадобиться несколько дней, но на этой стадии любые действия по спасению будут уже бессмысленны. Инкубационный период в среднем бывает около месяца, но может достигать и года. Каким же образом проявляется бешенство? Наиболее выраженные признаки:

• отек, зуд, покраснение на месте укуса животным;
• лихорадка, повышение температуры тела;
• отсутствие сил, постоянная усталость, недомогание;
• частые головные боли;
• нарушение нормального сна, бессонница;
• обострение к зрительным и слуховым раздражителям;
• судороги;
• депрессивное настроение, чувство апатии;
• постоянная смена страха и тревоги на агрессию и беспокойство;
• расстройства в работе дыхательной системы и проблемы с глотанием;
• учащение сердечного ритма, одышка;
• увеличение слюноотделения;
• неясность сознания, галлюцинации;
• паралич конечностей или другой части тела.

Инкубационный период

Данный период представляет собой промежуток от заражения вирусом до момента появления первых признаков недуга. Он длиться в течение месяца, но диапазон составляет от пары дней до целого года. Такие случаи крайне редки и случаются один раз на миллион случаев.

Скорость развития инкубационного периода напрямую зависит от расположения инфекции к головному мозгу. Чем ближе данный вирус, тем быстрее наступит неминуемая гибель. Укус лица или плеча будет способствовать более быстрому развитию событий, инкубационный период в таком случае может наступить уже через пару дней. Этот период крайне важен для человека, потому что за это время нужно успеть сдать кровь и узнать результаты анализа на бешенство у человека. Оперативная вакцинация дает шанс на спасение жизни.

Последующая симптоматика

После первых видимых проявлений наступают более выраженные признаки заражения. Существует две разновидности бешенства, которое прогрессирует:

• в большинстве случаев, в 80 из 100 наступает буйное бешенство;
• тихое бешенство, его еще называют паралитическое. Оно встречается реже.

Заключительная стадия – острый неврологический период.

Буйный тип заражения

В период буйного бешенства у людей может наблюдаться несвойственное им гиперактивное поведение, которое сменяется относительным непродолжительным спокойствием. Люди в этот момент ведут себя странно. Могут проявляться следующие признаки данного типа:

• возбуждение, часто граничащее с агрессией и озлобленностью. Человек может начать драку, наносить вред, не задумываясь о последствиях;
• усиленное слюноотделение, неконтролируемое;
• жар, высокая температура тела, горячка;
• чрезмерная потливость;
• галлюциногенные всплески, путаница в реальности;
• мурашки, волосы на коже становятся дыбом;
• стойкая эрекция у мужчин.

Во время буйства у людей, зараженных вирусом бешенства, может развиваться боязнь воды – гидрофобия. Возникают затруднения в дыхательной системе, появляются трудности с глотанием. Во время глотания мышцы охватывают спазм, что делает невозможным совершение такого знакомого рефлекса. Спазм может длиться всего несколько секунд, но повторяется при очередной попытке. Далее человек боится совершать попытки из-за страха снова испытать спазм. Могут так же проявляться и другие фобии, например, страх воздуха или яркого света.

Уже через пару дней человек впадает в кому, организм испытывает легочную или сердечную недостаточность и вскоре погибает.

Тихое бешенство

Такой тип вызван слабостью в мышечной структуре. Мышцы не только теряют силу, но и лишены чувствительности, а иногда и частично парализованы. Например, в кистях или стопах может возникнуть легкое онемение, перерастающее в неспособность двигать какими-то элементами конечностей. Такой недуг может распространиться по всему телу и полностью обездвижить человека.

Фобии при таком типе бешенства обычно не возникают. Участь человека все также предопределена: вначале кома, затем летальный исход.

Диагностические исследования

Чтобы врач мог диагностировать бешенство, необходимо подтвердить его следующими данными:

1. Факт взаимодействия с зараженным или бездомным животным, которое не было привито в течение года. Под контактом подразумевается взаимодействие со слюной больного животного, укус, обработка ран и пр.
2. Первые проявления инфицирования.
3. Материалы для анализа зараженного или подозрительного животного при возможности.
4. Результаты обследования человека с признаками бешенства.

При диагностике используют следующие способы обследования:

1. Забор тканей участка кожи для выявления антител в борьбе с вирусным заболеванием. Ткани берут с задней поверхности шеи либо же, как материал используется отпечаток роговицы глаза.
2. ПЦР. Материал для исследования – слюна или спинномозговая жидкость. Но такой анализ довольно дорогостоящий и выполняется не во всех лабораториях.
3. Исследование спинномозговой жидкости и анализ крови на определение уровня моноцитов.
4. Исследование участков головного мозга, которое доступно только после констатации смерти больного. В ходе подтверждения диагноза в нервных клетках находятся точки – тельца Негри, которые однозначно свидетельствуют о бешенстве.

Лечение заражения

Эффективных методов для лечения проявлений бешенства человечество до сих пор не открыло. Ранее все люди, независимо от своевременности обращения к врачу, заканчивали смертью. Но современная медицина предлагает использовать вакцинацию не только как профилактические меры, но и в качестве противодействия во время инкубационного периода заражения.

В истории есть только пара случаев выздоровления после комплекса противовирусного медикаментозного воздействия, однако в реальной жизни это работает крайне редко и почти никого не спасает от гибели.

Эффективность лечения возможна только сразу же после укуса, в процессе заражения. Своевременные действия могут обезопасить от развития симптоматики и смерти, но нельзя медлить. При заражении вирусом бешенства важна каждая минута, ведь именно она может стоить человеческой жизни.

304.00 ₽

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

• Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
• Курьерская доставка (7 дней)
• Самовывоз из московского офиса
• Почта РФ

Распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: - метод флуоресцирующих антител (МФА); - метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы – НГУК-1); - биопроба на белых мышах; - метод иммуноферментного анализа (ИФА); - реакция диффузионной преципитации (РДП).

3 Термины, определения и сокращения

4 Условия выполнения исследований и требования безопасности

5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные

6 Отбор проб

7 Метод флуоресцирующих антител (МФА)

8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейроблатомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1)

9 Биопроба на белых мышах

10 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

11 Реакция диффузионной преципитации (РДП)

Этот ГОСТ находится в:

Организации:

27.06.2013	Утвержден		57-П
30.09.2013	Утвержден		1127-ст
	Издан		2014 г.
	Разработан

Animals. Methods of laboratory diagnostic of rabies

Нормативные ссылки

• ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения . Заменен на ГОСТ 12.0.004-2015 .
• ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
• ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
• ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
• ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения
• ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
• ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
• ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний
• ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
• ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия
• ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний
• ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
• ГОСТ 24861-91 Шприцы инъекционные однократного применения
• ГОСТ 25046-81 Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний
• ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
• ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия
• ГОСТ 2768-84 Ацетон технический. Технические условия
• ГОСТ 29230-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
• ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
• ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования
• ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
• ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
• ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
• ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям . Заменен на ГОСТ ISO 7218-2015 .

стр. 1

стр. 2

стр. 3

стр. 4

стр. 5

стр. 6

стр. 7

стр. 8

стр. 9

стр. 10

стр. 11

стр. 12

ТЕРтр 81-07-14-2001

ТЕРтр-2001

ЯМАЛО-НЕНЕЦКИЙ АВТОНОМНЫЙ ОКРУГ

Часть 14

КАНАЛИЗАЦИОННЫЕ КОЛЛЕКТОРЫ

ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ

Салехард 2011

ТЕРРИТОРИАЛЬНЫЕ ЕДИНИЧНЫЕ РАСЦЕНКИ НА РАБОТЫ ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ ОБСЛУЖИВАНИЮ И РЕМОНТУ ОБОРУДОВАНИЯ ГОРОДСКОГО ХОЗЯЙСТВА

ТЕРтр 81-07-14-2001 ЯМАЛО-НЕНЕЦКИЙ АВТОНОМНЫЙ ОКРУГ Часть 14

КАНАЛИЗАЦИОННЫЕ КОЛЛЕКТОРЫ

Издание официальное

Салехард 2011

ББК 65.31 УДК 338.5:69 (083)

Территориальные сметные нормативы.

Территориальные единичные расценки на работы по техническому обслуживанию и ремонту оборудования городского хозяйства. Ямало-Ненецкий автономный округ.

ТЕРтр 81-07-14-2001 Часть 14. Канализационные коллекторы

Салехард, 2011 - 9 стр.

Территориальные единичные расценки на работы по техническому обслуживанию и ремонту оборудования городского хозяйства (далее - ТЕРтр) предназначены для определения затрат при выполнении на работы по техническому обслуживанию и ремонту оборудования городского хозяйства и составления на их основе сметных расчетов (смет) на производство указанных работ.

РАЗРАБОТАНЫ Сибирским центром ценообразования в строительстве, промышленности и

энергетике (ЗАО)

УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Правительства Ямало-Ненецкого автономного округа от 13.10.2011 № 755-п.

О ЯНАО 2011г.

Настоящие территориальные сметные нормативы не могут быть полностью или частично воспроизведены, тиражированы и распространены в качестве официального издания без разрешения Департамента строительства и жилищной политики Ямало-Ненецкого автономного округа.

ТЕРРИТОРИАЛЬНЫЕ ЕДИНИЧНЫЕ РАСЦЕНКИ НА РАБОТЫ ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ ОБСЛУЖИВАНИЮ И РЕМОНТУ ОБОРУДОВАНИЯ ГОРОДСКОГО ХОЗЯЙСТВА ЯМАЛО-НЕНЕЦКИЙ АВТОНОМНЫЙ ОКРУГ

ТЕРтр-14-2001

Номера расценок			В том числе, руб.
				эксплуатация машин		материалы
неучтенных ресурсов

Часть 14. Канализационные коллекторы

РАЗДЕЛ 1. СНЕГОСПЛАВНЫЕ СООРУЖЕНИЯ

Таблица ТЕРтр 14-01-001 Очистка от мусора камер отстаивания снегосплавных пунктов

Очистка от мусора камеры отстаивания снегосплавных пунктов: с площадкой отстаивания Очистка от мусора камеры отстаивания снегосплавных пунктов: без площадки отстаивания

Таблица ТЕРтр 14-01-002 Очистка от мусора снегосплавных пунктов с площадкой отстаивания

Измеритель: 1 м3 извлеченного мусора

Очистка от мусора (без доочистки вручную) снегосплавных пунктов с площадкой отстаивания: -снегосплавных камер (без решеток) Очистка от мусора (без доочистки вручную) снегосплавных пунктов с площадкой отстаивания: - снегосплавных камер, совмещенных с песколовкой, и песколовок

Номера расценок Наименование и характеристика строительных работ и конструкций В том числе, руб. эксплуатация машин материалы неучтенных ресурсов Наименование и характеристика неучтенных расценками материалов, (единица измерения) в т.ч. оплата труда машинистов

Таблица ТЕРтр 14-01-003 Консервация на летний период сооружений снегосплавных камер и песколовок

Измеритель: 1 м3 извлеченного мусора

Консервация на летний период: снегосплавленых камер (зона: 1) (зона: 2) (зона: 3) (зона: 4) Консервация на летний период: снегосплавленых камер, совмещенных с песколовкой, и песколовок

СМЕТНЫЕ РАСЦЕНКИ НА ЭКСПЛУАТАЦИЮ СТРОИТЕЛЬНЫХ МАШИН, СМЕТНЫЕ ЦЕНЫ НА МАТЕРИАЛЫ, ИЗДЕЛИЯ, КОНСТРУКЦИИ И ЧАСОВАЯ ОПЛАТА ТРУДА РАБОЧИХ-СТРОИТЕЛЕЙ

К БЛ ЗИСНЫХЦЕНАХ ПО СОСТОЯНИЮ НА 01.01.2000 Г.

Приложение 1. РАЗМЕР ЧАСОВОЙ ОПЛАТЫ ТРУДА РАБОЧИХ-СТРОИТЕЛЕЙ

Код ресурса Наименование ресурса Часовая оплата труда, руб. Рабочий среднего разряда 1 Рабочий среднего разряда 1Д Рабочий среднего разряда 1,2 Рабочий среднего разряда 1,3 Рабочий среднего разряда 1,4 Рабочий среднего разряда 1,5 Рабочий среднего разряда 1,6 Рабочий среднего разряда 1,7 Рабочий среднего разряда 1,8 Рабочий среднего разряда 1,9 Рабочий среднего разряда 2 Рабочий среднего разряда 2Д Рабочий среднего разряда 2,2 Рабочий среднего разряда 2,3 Рабочий среднего разряда 2,4 Рабочий среднего разряда 2,5 Рабочий среднего разряда 2,6 Рабочий среднего разряда 2,7 Рабочий среднего разряда 2,8 Рабочий среднего разряда 2,9 Рабочий среднего разряда 3 Рабочий среднего разряда 3,1 Рабочий среднего разряда 3,2 Рабочий среднего разряда 3,3 Рабочий среднего разряда 3,4 Рабочий среднего разряда 3,5 Рабочий среднего разряда 3,6

Код ресурса	Наименование ресурса			оплата груда, руб.
	Рабочий среднего разряда 3,7
	Рабочий среднего разряда 3,8
	Рабочий среднего разряда 3,9
	Рабочий среднего разряда 4
	Рабочий среднего разряда 4,1
	Рабочий среднего разряда 4,2
	Рабочий среднего разряда 4,3
	Рабочий среднего разряда 4,4
	Рабочий среднего разряда 4,5
	Рабочий среднего разряда 4,6
	Рабочий среднего разряда 4,7
	Рабочий среднего разряда 4,8
	Рабочий среднего разряда 4,9
	Рабочий среднего разряда 5
	Рабочий среднего разряда 5,1
	Рабочий среднего разряда 5,2
	Рабочий среднего разряда 5,3
	Рабочий среднего разряда 5,4
	Рабочий среднего разряда 5,5
	Рабочий среднего разряда 5,6
	Рабочий среднего разряда 5,7
	Рабочий среднего разряда 5,8
	Рабочий среднего разряда 5,9
	Рабочий среднего разряда 6

Приложение 2.

СМЕТНЫЕ РАСЦЕНКИ НА ЭКСПЛУАТАЦИЮ СТРОИТЕЛЬНЫХ МАШИН

Код ресурса			расценка,
	Домкраты гидравлические грузоподъемностью до 25 т

Код ресурса	Наименование строительных машин и механизмов		расценка,	в т.ч. оплата труда машинист ов
	Погрузчики одноковшовые универсальные фронтальные пневмоколесные
	Экскаваторы одноковшовые дизельные на пневмоколесном ходу при
	работе на других видах строительства 0,65 м3
	Краны на автомобильном ход}" 16 т
	Насосы фекальные, напор 24 м (ФГ 216/24)
	Насосы высокого давления "Керхер"
	Вентилятор радиальный общего назначения, производительностью 15000
	Станция насосная для привода гидродомкратов
	Электроводонагреватель
	Автомобили бортовые, грузоподъемность до 5 т
	Автомобиль-самосвал, грузоподъемность до 7 т
	Автомобиль-самосвал, грузоподъемность до 15 т

ТЕРтр-2001. Ямало-Ненецкий автономный округ. Часть 14. Канализационные коллекторы

ЧАСТЬ 14. КАНАЛИЗАЦИОННЫЕ КОЛЛЕКТОРЫ...................................................................3

РАЗДЕЛ 1. СНЕГОСПЛАВНЫЕ СООРУЖЕНИЯ........................................................................................................3

Таблица ТЕРтр 14-01-001 Очистка от мусора камер отстаивания снегосплавных пунктов........................................................3

Таблица ТЕРтр 14-01-002 Очистка от мусора снегосплавных пунктов с площадкой отстаивания.............................................3

Таблица ТЕРтр 14-01-003 Консервация на летний период сооружений снегосплавных камер и песколовок...........................4

СМЕТНЫЕ РАСЦЕНКИ НА ЭКСПЛУАТАЦИЮ СТРОИТЕЛЬНЫХ МАШИН, СМЕТНЫЕ ЦЕНЫ НА МАТЕРИАЛЫ, ИЗДЕЛИЯ, КОНСТРУКЦИИ И ЧАСОВАЯ

ОПЛАТА ТРУДА Р А КОЧИХ-С ТРОИТЕ Л ЕЙ...............................................................................5

Приложение 1. РАЗМЕР ЧАСОВОЙ ОПЛАТЫ ТРУДА РАБОЧИХ-СТРОИТЕЛЕЙ...........................................5

Приложение 2. СМЕТНЫЕ РАСЦЕНКИ НА ЭКСПЛУАТАЦИЮ СТРОИТЕЛЬНЫХ МАШИН.....................6

Приложение 3. СМЕТНЫЕ ЦЕНЫ НА МАТЕРИАЛЬНЫЕ РЕСУРСЫ..................................................................8

Бешенство - острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с леталь­ным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие жи­вотные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфек­ции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от ме­ста и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1-3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основ­ном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у со­бак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (па­ралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бе­шенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения мо­жет не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Про­никая с периферии (место укуса) по нервным стволам в централь­ную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, родуLyssavirus . Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион виру­са - РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5-10 мин, солнечный свет - за 5-7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5-10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наруж­ный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих анти­тел, а нуклеокапсидный - комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в централь­ной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культи­вируется на мышах, кроликах, морских свинках и других живот­ных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предваритель­ной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуци­рует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они переда­ют вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основ­ным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, име­ющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным мате­риалом необходимо строго соблюдать меры личной безопаснос­ти: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, ре­зиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защит­ные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством жи­вотных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала . Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных - голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектици­дами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые меш­ки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика . Она включает: обнаружение вирус­ного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуо­ресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ . На обезжиренных предметных стек­лах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов голов­ного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воз­духе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влаж­ную камеру при 37 °С на 25-30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, спо­ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, нано­сят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуорес­цирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах , но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть , нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицатель­ным считают результат при отсутствии специфической флуоресцен­ции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, име­ющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле . Метод основан на свойстве ан­тител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспери­ментальной инфекции (биопроба).